Dissertação/Tese Proteoma comparativo da região cambial de clones de Eucalyptus spp. e Corymbia spp. cultivados em diferentes espaçamentos - PPGCF

Diferenças fenotípicas observadas entre árvores cultivadas em diferentes espaçamentos de plantio, no que se refere a propriedades da madeira, podem ser atribuídas a uma diferença no padrão de abundância de proteínas no xilema secundário. Para entender em nível molecular como o espaçamento afeta o crescimento e a formação da madeira de um hibrido tri-cross de Eucalyptus urophylla S.T. Blake x (E. camaldulensis Dehn x E. grandis Hill ex Maiden) e de um híbrido de Corymbia citriodora (Hook) K. D. Hill & L. A. Johnson x C. torelliana (F. Muell) K. D. Hill & L. A. Johnson, uma abordagem proteômica foi empregada neste trabalho. Para isso, amostras do tecido cambial foram coletadas de clones, com 24 meses de idade, cultivados em quatro diferentes espaçamentos (3 x 3 m, 3 x 1 m, 6 x 1,5 m e 6 x 0,5 m). Diferentes protocolos foram comparados para extração das proteínas, sendo eles os métodos baseados no uso de TCA/acetona, TCA/acetona/fenol e solução tampão/fenol/acetato de amônio em metanol. As proteínas totais do tecido cambial foram separadas mediante eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Afim de promover um ensaio sensitivo e acurado, a proteômica do tipo “shotgun” (nLC-MS/MS-Orbitrap) foi a estratégia adotada. Para a identificação de proteínas, foram utilizados bancos de dados públicos de Eucalyptus grandis. As proteínas identificadas nos bancos de dados, quando não caracterizadas, foram funcionalmente anotadas com base na similaridade com sequências anotadas no UniRef90, usando o Sma3s. Por fim, as proteínas com diferença significativa (p<0,05) diferencialmente reguladas (fold-change entre 2 e 0,5) foram funcionalmente categorizadas usando a ferramenta MERCATOR-MapMan. Além disso, esse grupo de proteínas foi mapeado nos processos biológicos da base de dados Kegg. De modo geral, proteínas extraídas com solução tampão combinada com fenol e precipitadas com acetato de amônio em metanol apresentaram melhor qualidade, alto rendimento e bandas com melhores intensidades, em comparação com os outros métodos de extração, sendo este o método de extração usado. A análise eletroforética unidimensional revelou alterações no perfil proteico do câmbio vascular dos clones de Eucalyptus e Corymbia submetidos a diferentes espaçamentos de plantio. A estratégia de proteômica “shotgun” identificou 2547 espécies proteicas, das quais 1484 apresentaram diferenças significativas e mudanças qualitativas ou quantitativas em resposta a clones e espaçamentos de plantio. A análise estatística das proteínas identificadas e dos processos biológicos relacionados revelaram um comportamento diferente nos clones em relação à abundância de suas proteínas indicando um possível ajuste metabólico em função das condições ambientais proporcionadas pelos espaçamentos de plantio avaliados que refletiu nas características da madeira das referidas espécies.

The observed phenotypic differences between trees grown at different planting spacings, in wood properties, can be attributed to a difference in the pattern of protein abundance in the secondary xylem. To understand at the molecular level how the spacing affects the growth and the formation of the wood of a tri-cross hybrid of Eucalyptus urophylla S.T. Blake x (E. camaldulensis Dehn x E. grandis Hill ex Maiden) and a hybrid of Corymbia citriodora (Hook) KD Hill & LA Johnson x C. torelliana (F. Muell) KD Hill & LA Johnson, a proteomic approach was employed in this study. For this purpose, samples of the cambial tissue were collected from 24-month-old clones cultured in four different spacings (3 x 3 m, 3 x 1 m, 6 x 1,5 m and 6 x 0,5 m). Different protocols were compared for extraction of the proteins, being the methods based on the use of TCA / acetone, TCA / acetone / phenol and buffer / phenol / ammonium acetate solution in methanol. Total proteins of foreign cambial tissue were separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In order to promote a sensitive and accurate assay, shotgun-type proteomics (nLC-MS / MS-Orbitrap) was the strategy adopted. For the identification of proteins, public databases of Eucalyptus grandis were used. The proteins identified in the databases, when not characterized, were functionally annotated based on the similarity with sequences annotated in UniRef90, using the Sma3s. So, proteins with significantly (p <0.05) differentially regulated (fold-change between 2 and 0,5) were functionally categorized using the MERCATOR-MapMan tool. In addition, this group of proteins was mapped in the biological processes of the Kegg database. In general, proteins extracted with buffer solution combined with phenol and precipitated with ammonium acetate in methanol presented better quality, high yield and bands with better intensities, compared to the other extraction methods, being this the extraction method used in this study. The unidimensional electrophoretic analysis revealed changes in the protein profile of the cambial tissue of the Eucalyptus and Corymbia clones submitted to different planting spacings. The shotgun proteomics strategy identified 2547 protein species, of which 1484 showed significant differences and qualitative or quantitative changes in response to clones and planting spacings. Statistical analysis of identified proteins and related biological processes revealed a different behavior in the clones in relation to the abundance of their proteins indicating a possible metabolic adjustment as a function of the environmental conditions provided by the evaluated planting spacings that reflected the characteristics of the wood of said species.