Dissertação/Tese Bioinoculante Florestal: caracterização de microrganismos promotores de crescimento e seu uso na produção de mudas de eucalipto - PPGPV

O uso de microrganismos simbiontes, como fungos ectomicorrízicos e bactérias, tem sido uma alternativa promissora na produção vegetal e na ciclagem de nutrientes. Para o desenvolvimento de propriedade industrial, patentes e de dispersão de possíveis bioinsumos é necessário que haja caracterização genética destes microrganismos e estudo de dispersão geográfica, bem como a otimização do processo tecnológico por meio da experimentação dos bioinsumos em diferentes genótipos. Um dos desafios na implementação de biotecnologias microbianas na produção de bioenergia a partir de florestas é a inadequada compreensão dos mecanismos e modo de ação dos micro-organismos simbiontes. Para superar essa dificuldade, objetivou identificar as espécies de fungos ectomicorrízicos e bactérias, determinar o potencial de dispersão geográfico e a interação entre bactéria, fungo e planta para a promoção de crescimento de estacas de eucalipto na formação de mudas comerciais. Neste trabalho, o material genético de 28 fungos e 17 estirpes bacterianas isolados em cultivos comerciais de eucalipto no cerrado da Biosfera da Serra do Espinhaço Meridional foram submetidos a sequenciamento de regiões conservadas de 28S rRNA e 16S rRNA, para identificação e diversidade do acervo microbiano. Para criação de um modelo probabilístico de dispersão geográfica dos isolados fúngicos foi utilizado o algoritmo CLIMEX para projeções de 2020 a 2080, prospectando o cenário de bioinsumo com base nas plataformas de propriedade industriais no período de 1982 a 2023. Para formulação de inoculante, foram realizadas analises de atividade enzimática bacteriana, e as possibilidades de co-inoculação via compatibilidade entre bactérias e fungos, para filtrar as espécies com máximo potencial biotecnológico para inoculação em estacas de eucalipto. A produção de inoculantes bacterianos a partir de estirpes de Enterobacter hormaechei, Enterobacter asburiae, Paraburkholderia tropica e Paraburkholderia phenazinium, foi adicionada ao veículo carboximetilcelulose:amido e o inoculante contendo Pisolithus microcarpus foi preparado a partir de esferas de alginato de cálcio. A co-inoculação desses organismos foi utilizada para avaliar a promoção do crescimento de mudas de híbridos de eucalipto. O experimento foi instalado em blocos casualizados, em esquema fatorial 6 x 2 (+1), incluindo inoculação bacteriana de cada espécie, mix bacteriano (contendo as quatro estirpes), veículo (CMC:amido), com e sem inoculação da mistura de três isolados de Pisolithus microcarpus (D5, D17 e D63), com adubação reduzida (quanto de redução) de P-N em híbrido espontâneo de Eucalyptus cloeziana e E. urophylla x E. grandis, além de um tratamento adicional de alta dose de P-N (colocar a dose). Para determinação da promoção do crescimento, foram analisados aos 45 e 90 dias aspectos ecofisiológicos, nutricionais e microbiológicos das mudas. Os fungos ectomicorrízicos foram identificados como P. microcarpus com padrão morfológico variável conforme o seu habitat, com período de frutificação no outono-inverno brasileiro, em solos distróficos no Bioma de Cerrado. A diversidade genética atribui-se às diferenciações nucleotídicas existentes entre os isolados e não em relação à distância geográfica dos isolados. Podendo ser distribuídos em regiões Tropicais e Temperadas em todo o mundo, podendo sofrer deslocamento das áreas potencialmente de distribuição do nicho ecológico no Brasil e no mundo até o ano de 2080. Possuem interação intraespecífica com 100,0 % de compatibilidade e interação interespecífica de 80,0 % com as estirpes bacterianas, indicando um grande potencial para co-inoculação. A E. huaxiensis inibiu os cinco isolados fúngicos, possivelmente por produção de substância antifúngico. A estirpe P. phenazinium inoculada com o isolado D17 proporcionou o maior crescimento micelial, 24,0 % em relação ao controle, demonstrando a melhor interação de compatibilidade observada. O comportamento ecofisiológicos das plantas foram moduladas pelo tipo de co-inoculação em baixa dose de fertilização, promovendo mudas com alta qualidade fisiológica e padrão de comercialização igual ou superior ao padrão de produção de mudas com altas doses de fertilização. As estirpes E. hormaechei, E. asburiae, P. tropica e P. phenazinium e o Pisolithus microcarpus são potenciais recursos microbianos na formulação de novos inoculantes para reduzir o uso de fertilizantes fosfatados e nitrogenados. A replicabilidade e validação em épocas diferentes aos executados serão necessárias para determinar o potencial de crescimento das plantas de eucalipto.

The utilization of symbiotic microorganisms, such as ectomycorrhizal fungi and bacteria, has shown promising potential in plant production and nutrient cycling. In order to develop industrial properties, patents, and the dissemination of potential bio-inputs, genetic characterization of these microorganisms, geographical dispersal studies, and optimization of the technological process through experimentation on different genotypes are necessary. One of the challenges in implementing microbial biotechnologies for bioenergy production from forests is the inadequate understanding of the mechanisms and mode of action of symbiotic microorganisms. To overcome this difficulty, the objective was to identify species of ectomycorrhizal fungi and bacteria, determine their geographical dispersal potential, and investigate the interaction between bacteria, fungi, and plants in promoting the growth of eucalyptus cuttings for commercial seedling production. In this study, genetic material from 28 fungi and 17 bacterial strains isolated from commercial eucalyptus plantations in the Cerrado biome of the Southern Espinhaço Mountain Range was sequenced for conserved regions of 28S rRNA and 16S rRNA to identify and assess microbial diversity. A probabilistic model for geographical dispersal of fungal isolates was created using the CLIMEX algorithm for projections from 2020 to 2080, forecasting the bio-input scenario based on industrial property platforms from 1982 to 2023. For the formulation of an inoculant, analyses of bacterial enzymatic activity were performed, and the possibilities of co-inoculation via compatibility between bacteria and fungi were explored to select species with maximum biotechnological potential for eucalyptus cuttings. Bacterial inoculants were produced from strains of Enterobacter hormaechei, Enterobacter asburiae, Paraburkholderia tropica, and Paraburkholderia phenazinium, added to a carboxymethylcellulose:starch vehicle. The Pisolithus microcarpus inoculant was prepared using calcium alginate spheres. Co-inoculation of these organisms was used to evaluate growth promotion in hybrid eucalyptus seedlings. The experiment was set up in randomized blocks with a 6 x 2 (+1) factorial scheme, including bacterial inoculation of each species, bacterial mix (containing the four strains), vehicle (CMC:starch), with and without inoculation of a mixture of three Pisolithus microcarpus isolates (D5, D17, and D63), with reduced P-N fertilization (amount of reduction) in spontaneous hybrids of Eucalyptus cloeziana and E. urophylla x E. grandis. An additional treatment included high P-N dosage (specify the dose). To assess growth promotion, ecophysiological, nutritional, and microbiological aspects of the seedlings were analyzed at 45 and 90 days. The ectomycorrhizal fungi were identified as P. microcarpus, with a variable morphological pattern according to their habitat, exhibiting fruiting during the Brazilian autumn-winter on dystrophic soils in the Cerrado biome. Genetic diversity was attributed to nucleotide variations among the isolates rather than geographical distance. They can be distributed in Tropical and Temperate regions worldwide, with potential shifts in potentially suitable distribution areas for the ecological niche in Brazil and the world until the year 2080. They exhibit 100,0 % intraspecific interaction compatibility and 80% interspecific interaction compatibility with bacterial strains, indicating significant potential for co-inoculation. E. huaxiensis inhibited all five fungal isolates, possibly due to antifungal substance production. The strain P. phenazinium, inoculated with isolate D17, yielded the highest mycelial growth, 24,0 % more than the control, demonstrating the best observed compatibility interaction. The ecophysiological behavior of the plants was modulated by the type of co-inoculation under low fertilization, resulting in seedlings with high physiological quality and a commercial standard equal to or better than the standard for seedling production with high fertilization rates. The strains E. hormaechei, E. asburiae, P. tropica, P. phenazinium, and Pisolithus microcarpus represent potential microbial resources for formulating new inoculants to reduce the use of phosphate and nitrogen fertilizers. Replicability and validation in different timeframes will be necessary to determine the growth potential of eucalyptus plants.