Dissertação/Tese SÍNTESE, ANÁLISES ESTRUTURAIS, CONFORMACIONAIS E DE INTERAÇÃO DO PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO HSP1 EM MEIOS BIOMIMÉTICOS - PPGQ

Micro-organismos resistentes a antibióticos vêm atingindo índices elevados nos últimos anos, agravando problemas de saúde pública e econômicos. O impacto na sociedade devido à resistência de bactérias aos antibióticos convencionais tem mobilizado a pesquisa para o desenvolvimento de novas drogas. Nesse contexto, surgem os peptídeos antimicrobianos, que são moléculas efetoras do sistema imune inato e podem ser encontrados em praticamente todos os seres vivos. Para proteção contra os micro-organismos presentes em seu habitat, a pele de anuros apresenta um verdadeiro arsenal químico, constituído, em sua maioria, de diferentes classes de peptídeos. Dentre esses, os antimicrobianos são considerados os mais avançados participantes do sistema imunológico. Vários estudos sugerem que os peptídeos antimicrobianos podem atuar por diferentes mecanismo como micelização, formação de poros na superfície da membrana ou, ainda, pelo ataque a algum alvo intracelular. Embora a maioria dos modelos existentes proponham que peptídeos antimicrobianos exercem suas atividades biológicas por meio da interação com a membrana bacteriana, o mecanismo de ação dessas moléculas ainda não é completamente compreendido. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo obter informações estruturais, conformacionais e de interação em ambientes que mimetizam membranas biológicas, do peptídeo Hylaseptina P1 (HSP-1), composto por 14 resíduos de aminoácidos e isolado do anuro da espécie Hyla punctata visando o entendimento do seu mecanismo de ação. Neste trabalho, o peptídeo HSP-1 foi sintetizado manualmente através da síntese de peptídeos em fase sólida via estratégia Fmoc. As preferências conformacionais do peptídeo em meios micelares de dodecilsulfato de sódio (SDS), dodecilfosfocolina (DPC) e vesículas fosfolipídicas de 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (PC) e 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol (PG) foram avaliadas por Dicroísmo Circular. Observou-se que em meio aquoso HSP-1 adota estrutura desenovelada, enquanto que, em meios micelares e vesículas fosfolipídicas, apresentou conformação -hélice. A estrutura tridimensional foi estudada na presença de micelas de SDS e DPC por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear em solução, revelando que, em micelas de SDS o peptídeo HSP-1 exibe conformação helicoidal mais prolongada do que em micelas de DPC, no qual foi possível verificar pequena dobra da hélice na região N-terminal da cadeia peptídica, sugerindo maior inserção do peptídeo em micelas zwiteriônicas. O efeito da adição de peptídeo no tamanho e na carga superficial de vesículas fosfolipídicas de PC e PC:PG (3:1) foi investigado por medidas de espalhamento de luz dinâmica e Potencial Zeta. Verificou-se que a adição de HSP-1 resulta no aumento do diâmetro hidrodinâmico (∆Dh ≈ 20 nm) e aumento do potencial Zeta (∆ζ ≈ 15 mV) de vesículas unilamelares (LUV’s) de PC:PG, indicando interação eletrostática com a superfície das vesículas. Quando vesículas de PC foram tituladas com HSP-1, foi observada maior alteração no diâmetro hidrodinâmico das LUVs (∆Dh ≈ 22 nm), enquanto que não se observaram alterações significativas nos valores de potencial Zeta (∆ζ ≈ 0 mV), sendo indicativo de uma maior inserção do peptídeo em membranas zwiteriônicas. Conforme observado nos resultados de Calorimetria de Titulação Isotérmica, a interação com vesículas zwiteriônicas foi da ordem de 102 maior do que o valor encontrado para interação com vesículas negativas. Contudo, os dados termodinâmicos revelaram a predominância de interações eletrostáticas de HSP-1 com vesículas de PC:PG e hidrofóbicas com vesículas de PG. Finalmente, a capacidade de formação de poros de HSP-1 foi examinada por meio de medidas de extravasamento de carboxifluoresceína (CF) em vesículas de PC e PC:PG. Em PC-LUVs observou-se uma maior intensidade de fluorescência em comparação com PC:PG-LUVs, sugerindo uma maior atividade lítica do peptídeo em vesículas zwiteriônicas.

The resistance of microorganisms to antibiotics have reached high levels in recent years, exacerbating public health and economic problems. The impact of bacterial resistance on the global society has mobilized the research community for the development and new drugs discovery. In this context, antimicrobial peptides appear as an alternative antibiotics class, which are effector molecules of the innate immune system in almost every living beings. In order to protect against microorganisms present in their habitat the skin of frogs presents a real chemical arsenal consisting mostly of different peptides classes, which are considered the most advanced participants of the immune system. Several studies suggest that antimicrobial peptides may act by different models such as micellization, pore formation in membrane surface or also intracellular target attack. Although most of models propose that antimicrobial peptides exert their biological activities by interacting with the bacterial membrane, the mechanism of action is not still fully understood. In order to study the action mechanism of antimicrobial peptide Hylaseptina P1 (HSP-1), composed of 14 amino acid residues and isolated from Hyla punctate species, this work presents conformational and thermodynamic analysis of peptide-membrane interaction in biomimetic environments. In this work, the HSP-1 peptide was synthesized manually by solid phase peptide synthesis using Fmoc strategy. The conformational preferences of peptide were evaluated by Circular dichroism in sodium dodecylsulfate (SDS) and dodecilfosfocolina (DPC) micellar media or 1-palmitoyl-2-oleilfosfatidilcolina (PC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol (PG) phospholipid vesicles. A random conformation was observed to HSP-1 in aqueous medium while in micellar or phospholipid vesicles media HSP-1 showed a predominant -helix conformation. The three dimensional structure were obtained by solution Nuclear Magnetic Resonance in the presence of SDS and DPC micelles, revealing that HSP-1 exhibits a longer helical conformation in SDS than DPC micelles. In zwiterionic medium could be verified a subtle bend at the N-terminus, suggesting a partial insertion of the peptide in DPC micelles. The effects of adding peptide in size or surface charge of PC and PC:PG phospholipid vesicles were investigated by Dynamic Light Scattering and Zeta Potential measurements. The addition of HSP-1 to PC:PG-LUVs results in increasing of both hydrodynamic diameter (ΔDh ≈ 20 nm) and zeta potential (Δζ ≈ 15 mV), indicating an electrostatic interaction with the surface vesicles. On the other hand, when PC-LUVs were titrated with HSP-1 a greater change in hydrodynamic diameter (ΔDh ≈ 22 nm), no significant variations were observed in superficial charge, indicating a partial insertion of the peptide in zwitterionic PC membranes. In addition, the thermodynamic studies carried out by isothermal titration calorimetry showed a peptide-membrane interaction approximately 102 higher with PC-LUVs when compared to negative PC:PG-LUVs. Nevertheless, whereas the greater enthalpic contribution in PC:PG-LUVs revealed the predominance of electrostatic interactions with HSP-1, in PC vesicles predominate hydrophobic interactions. Finally, the ability of poring formation of HSP-1 was examined by carboxyfluorescein (CF) release from PC and PC:PG vesicles. It was observed a higher fluorescence intensity in PC-LUVs compared to PC:PG-LUVs, suggesting a greater lytic activity of the peptide in zwiterionic vesicles. The maximum percentage of CF released was approximately 65% to PC-LUVs and 50% to PC:PG-LUVs, confirming a greater membrane permeabilization in zwiterionic medium. Furthermore, this study has also demonstrated a lesser kinetics of CF leakage in PC-LUVs, consistent with a mechanism in which there is greater insertion of the peptide in the lipid bilayer interface.