Dissertação/Tese DESENVOLVIMENTO DE UM SENSOR PARA ANTICORPOS ANTI-LEISHMANIA INFANTUM EXPLORANDO O ANTÍGENO RECOMBINANTE C8 - PPGQ

O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um imunossensor fundamentado em espectroscopia de ressonância de plásmons de superfície (SPR) para a detecção de anticorpos anti–Leishmania infantum. O imunossensor foi desenvolvido utilizando monocamadas autoorganizadas (SAMs) de ácido mercaptopropiônico (3-MPA), ativada pela mistura de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e n-hidroxisuccinimida (NHS). O uso do par EDC/NHS possibilitou que maior quantidade de antígenos fossem imobilizados sobre a superfície da SAM bem como favoreceu a sensibilidade do dispositivo desenvolvido. Com o propósito de investigar a capacidade da SAM de 3-MPA frente à imobilização do antígeno, foram obtidos sensogramas para as etapas de associação sob diferentes concentrações do antígeno (10, 20, 30, 40 e 50 μg/ml). A avaliação da interação da SAM com o antígeno foi feita mediante um modelo de dois estágios, no qual, em um primeiro momento as moléculas do antígeno L. infantum são adsorvidas sobre a superfície e, após isso, são rearranjadas para uma forma compacta e estável. A caracterização do imunossensor foi conduzida por espectroscopia de impedância eletroquímica e microscopia eletroquímica de varredura. Finalmente, foram realizados testes com o imunossensor frente a soros caninos positivos em diferentes diluições, sendo possível observar que o imunossensor foi seletivo e sensível frente à amostra, uma vez que a adição de soro canino negativo na diluição de 1:320 não apresentou respostas características em relação ao soro positivo. O presente trabalho demonstra o sucesso do desenvolvimento de um sensor para anticorpos anti-Leishmania infantum explorando o antígeno recombinante C8

In the present work, a surface plasmon resonance (SPR) immunosensor was developed using a recombinant L. infantum C8 antigen modified gold SPR sensor chip for the detection of anti-Leishmania infantum antibodies in dogs serum samples. The principle of transduction used was the Surface Plasmon Resonance (SPR) and the sensor was constructed by covalent immobilization of soluble antigens of Leishmania infantum on self-assembled monolayers (SAMs) of 3 mercaptopropionic acid (MPA) which was activated by the mixture 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hidroxisuccinimide (NHS). The kinetic studies of the recombinant L. infantun C8 antigen immobilization indicated that the antigen layer is formed in a two-step adsorption process. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and scanning electrochemical microscopy (SECM) techniques were employed in the characterization of the antigen immobilization. After the sensor construction, the antiL.infantum antibody for Visceral Leishmaniasis was added to its surface and showed significant variation in the SPR angle, indicating excellent sensitivity of the technique for antigen-antibodies interaction. Indeed, the addition of negative canine serum at dilution of 1:320 to the sensor surface was accompanied by a small response in comparison to the response to positive canine serum. The present work demonstrates the successful development of an SPR sensor for anti-L. infantum antibodies detection based on recombinant C8 antigen.