Dissertação/Tese SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDOS DO MODO DE INTERAÇÃO DO PEPTÍDEO BIOATIVO ecPis-4s - PPGQ

Diante do uso indiscriminado de antibióticos têm-se observado o aumento acelerado da resistência antimicrobiana a estes medicamentos. Em consequência, a busca por novos agentes terapêuticos também tem sido ampliada na tentativa de vencer o desenvolvimento de microrganismos super-resistentes aos antibióticos usualmente empregados. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (PAM) têm sido descritos como uma alternativa para desenvolvimento de novas drogas no combate à patógenos, pois, podem atuar por diferentes mecanismos na superfície da membrana celular, porém, o mecanismo de ação dessas moléculas ainda não é completamente compreendido. Neste sentido, o presente trabalho propôs a síntese do PAM ecPis-4s, identificado e isolado da espécie de peixe Epinephelus coioides, para estudos do mecanismo de ação em membranas biomiméticas empregando diferentes técnicas biofísicas e estruturais. O ecPis-4s foi obtido quimicamente através da síntese de peptídeos em fase sólida via estratégia Fmoc. Utilizou-se a técnica de Dicroísmo Circular (CD) para se verificar as preferências conformacionais do peptídeo em meios micelares de dodecilsulfato de sódio (SDS) e vesiculares de fosfatidilcolina (POPC) e fosfatidilglicerol (POPG). Observou-se que tanto em meio micelar quanto vesiculares, o peptídeo ecPis-4s apresentou bandas características de conformação -helicoidal. A estrutura tridimensional, estudada em micelas de SDS por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) em solução revelou uma conformação helicoidal em praticamente toda a cadeia linear do peptídeo. Quando vesículas de POPC:POPG (3:1) foram tituladas em solução de ecPis-4s, observou-se uma intensa alteração no calor de reação da ordem de ΔH= - 3,3.103 cal.mol-1, revelando um maior potencial de interação e a predominância de interações eletrostáticas do peptídeo ecPis-4s com as vesículas aniônicas, quando se comparado à vesícula zwitteriônica de POPC. Esses valores juntamente com uma variação negativa da energia livre de Gibbs (ΔG), comprovam que a interação peptídeo-membrana ocorre mediante um processo espontâneo e altamente favorável. Dessa forma, este estudo mostra que o peptídeo ecPis-4s pode interagir fortemente com uma membrana negativa, como das bactérias, podendo perturbar a organização da bicamada lipídica resultando em lise celular.

In view of the indiscriminate use of antibiotics, the accelerated increase in antimicrobial resistance to these drugs has been observed. As a result, the search for new antimicrobial agents has also been broadened in order to face the resistance of microorganisms to the conventional antibiotics employed. In this context, antimicrobial peptides (AMP) has been widely reported as an alternative for the development of new therapeutic agents in the fight against super resistant pathogen microorganisms, since they can act by different mechanisms on the surface of the cell membrane, however the mechanism of action of these molecules is not yet fully understood. Therefore, the present work proposed the synthesis of the antimicrobial peptide ecPis-4s, identificated and isolated from the fish species Epinephelus coioides, for studies of the mechanism of action in bacterial mimetic membrane by using different biophysical and structural techniques. Firstly, the piscidin ecPis-4s was chemically synthetized by Solid-Phase Peptide Synthesis using the Fmoc strategy. The Circular Dichroism (CD) technique was used to access the conformational preferences of the peptide in presence of phospholipid vesicles composed of phosphatidylcholine (POPC), phosphatidylglycerol (POPG) and dodecylsulfate (SDS) micelles. Whereas in presence of phospholipid vesicles and of micellar media, the peptide acquires presented an -helical conformation. The three-dimensional structure was studied in the presence of SDS micelles by solution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, as previously indicated by CD experiments, helical conformation throughout the linear chain of the peptide. When POPC:POPG vesicles (3:1) were titrated in peptide solution, an intense change in the heat of the peptide-membrane interaction (ΔH = -3,3.103 cal.mol-1) was observed, revealing a greater potential of interaction when compared to the zwitterionic vesicle of POPC and suggesting the predominance of electrostatic interactions between peptide ecPis-4s and POPC:POPG vesicles. In addition, the negative variation of the Gibbs free energy (ΔG), prove that the peptide-membrane- interaction occurs in a spontaneous and highly favorable process. Therefore, this study shows that the ecPis-4s peptide by interacting strongly with a negative membrane, such as bacteria, can disrupt the organization of the lipid bilayer resulting in cell lysis.