Dissertação/Tese SÍNTESE QUÍMICA, AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO E ESTUDOS DE INTERAÇÃO COM MEIOS BIOMIMÉTICOS DE GLICOPEPTÍDEOSGLICOPEPTÍDEO-TRIAZÓIS DERIVADOS DE HSP-1 - PPGQ

O presente trabalho propõe a glicosilação do peptídeo antimicrobiano HSP-1, composto por 14 resíduos de aminoácidos e isolado originalmente da espécie Hyla punctata (PRATES et al., 2004) empregando-se a síntese de peptídeos em fase sólida associada a reação de cicloadição catalisada por cobre (SHARPLESS et al., 2002). Para isto, foi realizada a síntese do peptídeo HSP-1 propargilado ([PAG1]HSP-1) através da metodologia de síntese de peptídeo em fase sólida (SPFS) via estratégia Fmoc. Após a confirmação da obtenção do [PAG1]HSP-1 por espectrometria de massa (MALDI-ToF), foi realizada a glicosilação com as inserções dos derivados azido acetilado de glicose e N-acetilglicosamina na presença de sulfato de cobre penta hidratado (CuSO4.5H2O) e de ascorbato de sódio como agente redutor para obtenção dos glicopeptídeo-triazóis [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1. Os produtos das sínteses foram purificados por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (CLAE-FR) e também caracterizados por espectrometria de massa (MALDI-ToF), confirmando a formação regiosseletiva dos glicopeptídeo-triazóis sem produção de subprodutos da glicosilação. Os estudos biológicos comparativos entre o peptídeo HSP-1 e de suas formas glicosiladas revelaram que as modificações químicas não alteraram significativamente a eficácia do HSP-1 contra agentes bacterianos. Entretanto, os testes antifúngicos demonstraram melhor atividade fungicida para os glicopeptídeos quando comparado ao peptídeo HSP-1. Foram ainda realizados estudos conformacionais e de interação entre o peptídeo e os glicopeptídeos com vesículas fosfolipídicas de caráter zwitteriônico (POPC) e aniônico (POPC/POPG). Os estudos conformacionais empregando-se a técnica de Dicroísmo Circular (CD) revelaram menor teor de helicidade tanto em LUV’s de POPC quanto de POPC/POPG para os glicopeptídeos em relação a HSP-1. Os estudos de interação foram realizados empregando-se as técnicas de espalhamento de luz dinâmico (DLS), potencial zeta () e extravasamento de carboxifluoresceína (CF). De uma maneira geral, verifica-se que a variação no diâmetro hidrodinâmico (Dh) para vesículas zwitteriônicas POPC e aniônicas POPC/POPG é maior para os glicopeptídeos [Glc-trz-G14]HSP-1e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 em relação ao HSP-1. Por outro lado, a variação do potencial zeta tanto em vesículas zwitteriônicas quanto em vesículas predominantemente negativas causada por HSP-1 foi maior em comparação ao efeito causado pelas formas glicosiladas. E por fim, os resultados de extravasamento de carboxifluoresceína induzida por cada espécie (HSP-1, [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1) mostrou que a capacidade lítica dos glicopeptídeos é ligeiramente maior em ambos os meios biomiméticos quando comparados com o peptídeo HSP-1. Assim sendo, este trabalho mostrou que a presença do anel triazólico pode ser responsável pela maior atividade antifúngica dos glicopeptídeos [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 em relação ao peptídeo HSP-1.

This work proposes the glycosylation of the antimicrobial peptide HSP-1, containing 14 amino acid residues and originally isolated from Hyla punctata species (PRATES et al., 2004) by solid phase peptides synthesis associated with cycloaddition reaction copper catalyzed (SHARPLESS et al., 2002). The synthesis of propargylated HSP-1 ([PAG1] HSP-1) was carried out by solid phase peptide synthesis using Fmoc strategy and characterized by mass spectrometry (MALDI-ToF). In order to obtain the glycopeptide triazoles [Glc-trz-G14]HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14]HSP-1, azide derivatives acetylated glucose and N-acetylglucosamine were used in the presence of copper sulfate pentahydrate (CuSO4. 5H2O) and sodium ascorbate as a reducing agent. The products were purified by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and characterized by mass spectrometry (MALDI-ToF), confirming the regioselective reaction without glycosylation secondary products. Comparative studies among HSP-1 peptide and their glycosylated forms don’t show significant changes in antibacterial assays. However, the antifungal tests have shown a significant increase in fungicidal activity for glycopeptides when compared to HSP-1 peptide. Furthermore, it were carried out conformational and interaction studies among the peptide and glycopeptides with zwitterionic (POPC) and anionic (POPC/POPG) phospholipid vesicles. The circular dichroism (CD) spectra have revealed lower helicity to glycopeptides relative HSP-1 in both zwitterionic and anionic LUV's. Interaction studies were performed employing the dynamic light scattering (DLS), zeta potential and leakage carboxyfluorescein (CF) techniques. Summing up, the hydrodynamic diameter variation (∆Dh) for zwitterionic and anionic vesicles is greater for glycopeptides [Glc-trz-G14]HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 when compared with HSP-1. On the other hand, the zeta potential variation in zwitterionic or negative vesicles caused by HSP-1 was higher compared to the effect caused by glycosylated forms. Finally, the results of carboxyfluorescein leakage induced by each species (HSP-1 [Glc-trz-G14] HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14] HSP-1) showed a higher lytic capacity of glycopeptides in both media in relation to the HSP-1 peptide. Thus, it showed that the presence of triazole rings may be responsible for the higher antifungal activity of derivatives [Glc-trz-G14] HSP-1 and [GlcNAc trz-G14] HSP-1.