Dissertação/Tese OXIDAÇÃO ELETROCATALÍTICA DE NADH EMPREGANDO UM NOVO SENSOR À BASE DE UM COMPLEXO MACROCÍCLICO N4 SOBRE GRAFENO E DNA - PPGQ

β-Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e sua forma oxidada correspondente (NAD+) representam uma coenzima de grande importância em centenas de reações naturais catalisadas por enzimas desidrogenase, sendo vitais no metabolismo respiratório mitocondrial por estimular a produção de energia e atuam como principais transportadoras de cargas centrais em células vivas. Por estes motivos, a determinação eletroquímica de NADH tem atraído considerável atenção no desenvolvimento de sensores. Neste trabalho foi desenvolvido um sensor para a determinação voltamétrica de NADH de forma sensível e seletiva. O método baseia-se num eletrodo de carbono vítreo modificado com ftalocianina tetrassulfonada de níquel (NiTsPc - complexo macrocíclico N4), grafeno e DNA, designado por ECV/Grafeno/DNA/NiTsPc. A espectroscopia de infravermelho por transformada de fourier foi utilizada para caracterizar os materiais que compõem a modificação. O processo de oxidação do NADH foi investigado por voltametria cíclica (VC), cronoamperometria e voltametria de pulso diferencial (VPD). O sensor Grafeno/DNA/NiTsPc apresentou uma excelente atividade catalítica para a oxidação de NADH em baixo potencial. Parâmetros experimentais que influenciam a resposta analítica do sensor foram investigados. As condições ótimas, para a eletrocatálise da oxidação de NADH sobre o ECV/Grafeno/DNA/NiTsPc, foram encontradas para o eletrodo modificado com 0,5 mg mL-1 de grafeno e 1 mmol L-1 de NiTsPc, com a concentração de DNA pré estabelecida em 2 mg mL-1, utilizando-se o tampão fosfato 0,1 mol L-1 (pH 7,0) como eletrólito suporte. O estudo da cinética da reação de oxidação de NADH sobre o ECV/Grafeno/DNA/NiTsPc permitiu concluir que a reação promovida é de ordem estequiométrica 1, envolve 2 elétrons e ocorre de forma rápida uma vez que o Kobs obtido foi 7,35 x 105 mol-1 L s-1. As correntes de pico voltamétricas apresentaram uma resposta linear para a concentração de NADH no intervalo de 1 a 200 µmol L-1 para n = 9 (R = 0,998), com sensibilidade, limite de detecção e limite de quantificação iguais a 0,010 µA L mol-1, 0,3 µmol L-1 e 1 µmol L-1, respectivamente. Estudos de adição e recuperação do analito foram realizados para avaliar a exatidão do método e verificou-se que foi possível uma porcentagem de recuperação entre 99,8 e 101,0% para o NADH. A repetibilidade de medidas e a reprodutibilidade do preparo do sensor foram avaliadas pelo desvio padrão relativo de 10 determinações de NADH a 50 µmol L-1, obtendose DPR’s (Desvios Padrões Relativos) iguais a 2,33 e 3,13 %, respectivamente. A interferência de espécies que podem coexistir com o NADH em fluidos biológicos foi avaliada e concluiu-se que o sensor foi seletivo para o analito. Contudo, o sensor desenvolvido de forma simples, porém efetiva, pode ser aplicado para a determinação de NADH.

β-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and its corresponding oxidized form (NAD+) represent a coenzyme of great importance in hundreds of natural reactions catalyzed by dehydrogenase enzymes, being vital in mitochondrial respiratory metabolism by stimulating the production of energy and act as the main carriers central loads in living cells. For these reasons, the electrochemical determination of NADH has attracted considerable attention in the development of sensors. In this work was developed a sensor for the voltammetric determination of NADH sensitively and selectively. The method is based on a glassy carbon electrode modified with tetrasulfonated nickel phthalocyanine (NiTsPc - N4 macrocyclic complex), graphene and DNA, designate ECV/Graphene/DNA/NiTsPc. Fourier transform infrared spectroscopy was used to characterize the materials composing the modification. The NADH oxidation process was investigated by cyclic voltammetry (CV), chronoamperometry and differential pulse voltammetry (DPV). The sensor Graphene/DNA/NiTsPc showed an excellent catalytic activity for NADH oxidation in low potential. Experimental parameters which influence the analytical response of the sensor were investigated. The optimum conditions for the NADH oxidation electrocatalytic on ECV/Graphene/DNA/NiTsPc were found to the modified electrode with 0,5 mg mL-1 of graphene and 1 mmol L-1 NiTsPc, with the concentration of DNA predetermined at 2 mg mL-1 using the phosphate buffer 0.1 mol L-1 (pH 7.0) as supporting electrolyte. The study of the kinetics of the reaction of NADH oxidation on the ECV /Grafeno/DNA/NiTsPc allowed us to conclude that the reaction promoted is of stoichiometric order 1, involves 2 electrons and occurs quickly once the Kobs obtained was 7.35 x 105 mol-1 L s-1. The voltammetric peak currents showed a linear response for NADH concentration in the range from 1 up 200 mmol L-1 for n = 9 (R = 0.998), with a sensitivity, detection limit and quantification limit of 0.010 µA L mol-1, 0.3 µmol L-1 and 1 µmol L-1, respectively. Studies of addition and recovery of the analyte were carried out to evaluate the accuracy of the method and was verified a recovery percentage between 99,8 and 101,0% for NADH. The repeatability of the measurements and the reproducibility of the preparation of the sensor were evaluated by means of the Relative Standard Deviation (RSD) for 10 measurements of NADH 50 µmol L-1, obtaining RSD (Relative Standards Deviations) equal to 2.33 and 3.13%, respectively. The interference of species that can coexist with the NADH in biological fluids was evaluated and it was concluded that the sensor was selective for the analyte. However, the sensor developed in a simple, but effective, can be applied to the determination of NADH.