Dissertação/Tese Eletrossíntese, caracterização e aplicação de filmes poliméricos derivado da 2-aminobenzamida para o desenvolvimento de um genossensor eletroquímico para a COVID-19. - PPGQ

O presente trabalho propõe o desenvolvimento um genossensor eletroquímico utilizando eletrodo de grafite modificados com filmes poliméricos derivados da 2-aminobenzamida (2-AB), sobre os quais foram imobilizadas duas sondas de RNA, complementares à região conservada do genoma do SARS-CoV-2 (região N do vírus) de modo a promover interação específica entre ambos. A estratégia consiste no reconhecimento indireto da hibridização a partir do monitoramento da redução do azul de metileno (AM), agente intercalador de RNA, por voltametria de onda quadrada. O transdutor eletroquímico foi otimizado em função do sinal do AM adsorvido nas sondas. O poli(2-AB) apresenta perfil eletroquímico com dois pares redox em solução 0,50 M de H2SO4 e uma baixa resistência a transferência eletrônica em solução de ferro/ferricianeto de potássio, conforme análises de voltametria cíclica e espectroscopia de impedância eletroquímica. O processo de oxidação eletroquímica da 2-AB envolve um elétron e um próton, onde a polimerização ocorre via átomo de nitrogênio do grupo amino. Utilizando eletrodos impressos de grafite, o genossensor foi desenvolvido utilizando 0,25 mM de 2-AB preparada em 0,50 M de H2SO4 com 15 ciclos de potencial de -0,2 a +1,0 V a 50 mV/s, e na imobilização dos oligonucleotídeos utilizou-se 7,0 L de solução 0,1 M (30 min), sendo estas consideradas as condições ótimas. O tempo de reação com ao alvo específico foi otimizado em 10 min. O genossensor conseguiu identificar a presença do RNA viral em amostras plasmidiais alcançando LOD de 3,89 cópias/mL e um LOQ de 12,97 cópias/mL numa faixa linear de 13,5 a 625 cópias/mL, apresentando funcionalidade quando aplicado para análise em amostras clínicas, onde mostrou 32% de diferença do sinal do AM para as amostras positivas e 14% para as negativas, quando comparadas ao sinal do genossensor. Estudos de reprodutibilidade os mostraram valores de RSD de 12,2% (n=5), e de estocagem uma perda de resposta de 18% para 45 dias armazenados a temperatura de 5 a 10 °C. Análises com 10 amostras para quatro grupos denominados como: genossensor, positivas, negativas e interferentes (Influenza A, Influenza B e HIV, além do SARS-CoV-2 na presença do RNA viral da Influenza A e Influenza B) foram utilizadas para avaliar a sensibilidade e especificidade do biossensor. O teste t comprovou que o grupo de amostras positivas é de fato diferente de todos os demais grupos (p<0,05), enquanto os sinais obtidos para o genossensor, alvo não complementar e interferentes foram considerados como equivalentes (p>0,05). Com base nesses resultados, mostramos que a plataforma funcionalizada com o poli(2-AB) mostrou-se promissora para a detecção do SARS-CoV-2.

The present work proposes the development of an electrochemical genosensor using graphite electrode modified with polymeric films derived from 2-aminobenzamide (2-AB), on which two RNA probes, complementary to the conserved region of the SARS-CoV-2 genome (N-region of the virus), were immobilized, to promote specific interaction between them. The strategy consists of indirect recognition of hybridization by monitoring the reduction of methylene blue (AM), an RNA intercalating agent, by square wave voltammetry. The electrochemical transducer was optimized observing the AM reduction signal adsorbed on the probes. Poly(2-AB) has an electrochemical profile with two redox pairs in a 0.50 M solution of H2 SO4 and a low resistance to electronic transfer in an potassium ferro/ferricyanide solution, according to cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. The electrochemical oxidation process of 2-AB involves an electron and a proton, where polymerization takes place via the nitrogen atom of the amino group. Using printed graphite electrodes, the genossensor was developed using 0.25 mM of 2- AB prepared in 0.50 M H2 SO4 with 15 cycles potential of -0.2 to +1.0 V to 50 m V/s, and in the immobilization of the oligonucleotides, 7 L of a 0.1 M solution (30 min) were used, which were considered the optimal conditions. Target-specific reaction time was optimized by 10 min. The genosensor was able to identify the presence of viral RNA in plasmid samples reaching a linear range of 13.5 to 625 copies/mL and LOD of 3.89 copies/mL and LOQ of 12.97 copies/mL, presenting functionality when applied for analysis in clinical samples, where it showed a 32% difference in the AM signal for positive samples and 14% for the negative ones, when compared to the genosensor signal. And studies showed the reproducibility RSD values of 12.2% (n = 5), and a loss of response of 18% after 45 days stored at 5 at 10°C. Analyzes with 10 samples for four groups named as: genosensor, positive, negative, and interfering (Influenza A, Influenza B and HIV, in addition to SARS-CoV-2 in the presence of viral RNA from Influenza A and Influenza B) were used to evaluate the sensitivity and specificity of the biosensor. The t-test proved that the group of positive samples is in fact different from all other groups (p<0.05), while the signals obtained for the genosensor, non-complementary target and interfering ones were considered as equivalent (p>0.05). Based on these results, we show that the platform functionalized with poly(2-AB) proved to be promising for the detection of SARS-CoV-2.