Dissertação/Tese ELETROSSÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE FILMES POLIMÉRICOS DE POLI(ÁCIDO 2-HIDROXICINÂMICO) EM IMUNOSSENSORES IMPEDIMÉTRICOS PARA DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE VISCERAL EM AMOSTRAS DE SOROS CANINOS - PPGQ

A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é considerada um problema de saúde pública causada por um protozoário do gênero Leishmania que acomete cães, o qual no ciclo urbano de transmissão é o principal reservatório. Neste trabalho, investigou-se o desenvolvimento de um imunossensor impedimétrico sobre eletrodos de grafite (EG) e eletrodos impressos de óxido de grafeno (EIG) modificados com filmes poliméricos para detecção de Leishmaniose infantum em amostras de soros caninos. Os EG e o EIG foram modificados pela eletrodeposição do ácido 2-hidroxicinâmico (2-HCA). A eletropolimerização do 2-HCA foi realizada por voltametria cíclica (VC), utilizando-se solução monomérica 2,50 mM preparada em H2SO4 0,50 M contendo 1,0 mL de etanol. Para o EG utilizou-se 100 ciclos de potencial na faixa de +0,20 a +1,20 V a 50 mV/s e para o EIG 15 ciclos consecutivos de potencial de 0,00 a +1,00V a 100 mV/s. Para ambos os eletrodos modificados o poli(2-HCA) apresentou características adsortivas e eletroativas. Estudos de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) foram realizados para avaliar as propriedades elétricas dos eletrodos modificados. Para o EG/2-HCA utilizou-se o circuito equivalente descrito como (Rs(R-Qp)(Qdl[RtcW]) onde obteve-se o valor de resistência a transferência de carga (Rtc) de 13,2 kΩ, enquanto que para EIG/2-HCA o circuito equivalente proposto foi o de Randles, no qual o valor de Rtc foi de 4,2 kΩ. Visando a miniaturização do sistema, optou-se pelo desenvolvimento do biossensor sobre os EIG. Desta forma, foram colocados sobre a superfície dos EIG/2-HCA, utilizando a técnica de adsorção, 35 L de diferentes concentrações do antígeno L. infantum (Ag) (15, 30, 50, 70 e 100 g/mL), sendo realizados testes de interação com amostras de soros caninos contendo os anticorpos positivos (Ac+) de L. infantum em diferentes proporções 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1280 diluídos em tampão HBS-EP pH 7,40 com 20 minutos de interação a 37 °C. Os melhores resultados foram obtidos utilizando-se o antígeno em concentração de 50 g/mL durante 20 min a 37 ºC e a diluição do soro de 1:320. Posteriormente, avaliou-se o tempo de imobilização do Ag e de imunorreação Ag-Ac em 20, 40 e 60 minutos. Obteve-se 20 min de como tempo ideal de imobilização de Ag e para imunorreação Ag-Ac+. Após otimização destes parâmetros, avaliou-se a resposta do imunossensor na presença de amostras de soros caninos diagnosticados como positivos (Ac+) e negativos (Ac-) para Leishmaniose infantum, onde observou-se valores de Rtc para o sistema Ag-Ac+ 82% maior do que o obtido para o Ag-Ac-, demonstrando margem de segurança confiável no reconhecimento do analito de interesse. O imunossensor proposto para detecção de Leishmaniose infantum apresentou boas perspectivas para aplicação ao diagnóstico da doença, podendo-se tornar mais uma alternativa para realização de testes rápidos e de simples aplicação para detecção de LVC.

Visceral Canine Leishmaniasis (LVC) is considered a public health issue caused by a protozoan of the Leishmania genre that attacks dogs, which is the main reservoir in the urban transmission cycle. In this work, we investigated the development of an impedimetric immunosensor on graphite electrodes (GE) and graphene oxide-modified screen-printed carbon electrode (GSP) both modified with polymeric films to detect Leishmaniose infantum in canine serum samples. The GE and GSP were modified by the electrodeposition of 2-hydroxycinnamic acid (2-HCA). Electropolymerization of 2-HCA was performed by cyclic voltammetry (CV) using a 2.50 mM monomeric solution prepared in 0.50 M H2SO4 containing 1.0 mL of ethanol. For the EG and EIG, 100 cycles of potential between +0.20 and +1.20 V at 50 mV/s and 15 cycles of potential between 0.00 and + 1.00 V at 100 mV/s were used, respectively. Poly(2-HCA) shown adsorptive and electroactive characteristics for both electrodes. Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) studies were performed to evaluate the electrical properties of the modified electrodes. For the GE/2-HCA was used an equivalent circuit described as (Rs(RpQp)(Qdl[RtcW]), and a resistance of charge transfer (Rct) of 13.2 kΩ was obtained. For GSP/2-HCA the proposed equivalent circuit was that of Randles in which the value of Rct obtained was 4.2 kΩ. For system miniaturization it was developed the biosensor over GSP. Thus, 35 L of different concentrations of L. infantum antigen (Ag) (15, 30, 50, 70 e 100 g/mL) were placed on the GSP/2-HCA surface using the adsorption technique. Interaction tests were carried out with canine serum samples containing the positive antibodies (Ac+) of L. infantum in different proportions of 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1280, diluted in HBS-EP buffer pH 7.4 with 20 minutes of interaction at 37 ºC. The best results were obtained using the antigen at a concentration of 50 μg/mL for 20 min at 37 °C and a serum dilution of 1:320. Subsequently, the Ag immobilization and Ag-Ac immunoreaction time were evaluated in 20, 40 and 60 min. 20 min was obtained as the ideal time for Ag immobilization and Ag-Ac+ immunoreaction. After optimization of these parameters, the immunosensor response was evaluated in the presence of canine serum diagnosed as positive (Ac+) and negative (Ac-) for Leishmaniose infantum, where the Rct values for the Ag-Ac+ system were 82% higher than those obtained for Ag-Ac , demonstrating a reliable safety margin in the recognition of the analyte of interest. The proposed immunoassay for the detection of Leishmaniasis infantum presented good prospects for application in the diagnosis of the disease, and it could become an alternative for performing rapid tests and simple application for the detection of LVC.