Dissertação/Tese Rafael Mendes Coelho - PPGQ

Nos últimos anos, houve notáveis avanços na detecção de analitos clínicos, substâncias químicas ou componentes presentes em amostras biológicas, por meio de técnicas eletroquímicas, impulsionados pela praticidade, custo-benefício, alta sensibilidade e rapidez em comparação com métodos sorológicos tradicionais. Os eletrodos de grafite de lapiseira (PGE) surgem como alternativas promissoras devido à sua acessibilidade econômica e versatilidade para funcionalização. O Vaccinia vírus (VACV), membro da família Poxviridae, é conhecido por ser utilizado na vacinação contra a varíola, obviamente em sua forma inativa, mas permanece relevante na medicina veterinária, causando a varíola bovina em bovinos. Detectar o VACV é crucial devido às implicações na saúde pública e animal. Na medicina veterinária, sua detecção precoce é fundamental para prevenir surtos que podem afetar a produção de alimentos e a economia agrícola. Além disso, a identificação rápida do VACV é crucial para evitar a disseminação do vírus entre animais e, potencialmente, para humanos, garantindo a segurança alimentar e protegendo a saúde pública contra possíveis surtos zoonóticos. Investigações em novos métodos, como biossensores, oferecem uma abordagem para a detecção do vírus, tornando possível identificá-lo de forma rápida, sensível, com um baixo custo sem a necessidade de equipamentos ou pessoal especializado. Neste trabalho, utilizou-se os PGE para desenvolver um imunossensor impedimétrico para o VACV, avaliando diferentes métodos de ativação dos PGE e sua funcionalização com filmes poliméricos (FP). Os PGE foram ativados por processos físicos, químicos e eletroquímicos, com o tratamento de +1,8 V por 5 minutos em 0,5 mol L -1 de KCl demonstrando os melhores resultados. A eletropolimerização foi conduzida com vários monômeros para formar os FP, com o poli(2- hidroxibenzamida) apresentando aumento de 162% em termos de resistência à transferência de carga na presença de anticorpos específicos (controle específico). Foram exploradas duas estratégias para o desenvolvimento do imunossensor, imobilizando-se o VACV para detectar anticorpos anti-VACV (tipo ), bem como a construção inversa (tipo ). Os FP de poli(4-HXB) mostraram os melhores resultados em ambas as estratégias. Além disso, foram otimizamos as etapas de imobilização do biorreceptor (100 ng/mL por 30 minutos) e do agente de bloqueio da superfície (BSA 0,01% por 10 minutos) e o tempo de resposta do imunossensor (30 minutos). Sob as condições otimizadas, o imunossensor impedimétrico apresentou uma faixa linear de resposta entre 7.140 e 16.670 partículas/mL para o VACV, com um limite de detecção (LOD) de 639 partículas/mL e um limite de quantificação (LOQ) de 2.121 partículas/mL. Análises de reações cruzadas com outras amostras virais mostraram que apenas o monkeypox apresentou um sinal significativo, correspondendo a 55% do obtido para o VACV. Esses resultados indicam a aplicabilidade do imunossensor proposto na detecção do VACV em amostras biológicas, utilizando os PGE de uma forma simples e acessível.

In recent years, there have been notable advances in the detection of clinical analytes, chemical substances or components present in biological samples, using electrochemical techniques, driven by their practicality, cost-effectiveness, high sensitivity and speed compared to traditional serological methods. Pencil graphite electrodes (PGE) have emerged as promising alternatives due to their affordability and versatility for functionalization. Vaccinia virus (VACV), a member of the Poxviridae family, is known to be used in smallpox vaccination, obviously in its inactive form, but remains relevant in veterinary medicine, causing cowpox in cattle. Detecting VACV is crucial because of the implications for public and animal health. In veterinary medicine, its early detection is key to preventing outbreaks that can affect food production and the agricultural economy. In addition, rapid identification of VACV is crucial to prevent the spread of the virus between animals and potentially to humans, ensuring food safety and protecting public health against possible zoonotic outbreaks. Research into new methods, such as biosensors, offers an approach to detecting the virus, making it possible to identify it quickly, sensitively and at a low cost without the need for specialized equipment or personnel. In this work, PGE were used to develop an impedimetric immunosensor for VACV, evaluating different methods of PGE activation and their functionalization with polymeric films (PF). The PGE were activated by physical, chemical and electrochemical processes, with the treatment of +1.8 V for 5 minutes in 0.5 mol L -1 of KCl showing the best results. Electropolymerization was conducted with various monomers to form the PFs, with poly(2-hydroxybenzamide) showing a 162% increase in terms of resistance to charge transfer in the presence of specific antibodies (specific control). Two strategies were explored for the development of the immunosensor, immobilizing the VACV to detect anti- VACV antibodies (type ), as well as the reverse construction (type ). Poly(4-HXB) FP showed the best results in both strategies. In addition, the immobilization steps of the bioreceptor (100 ng/mL for 30 minutes) and the surface blocking agent (BSA 0.01% for 10 minutes) and the response time of the immunosensor (30 minutes) were optimized. Under the optimized conditions, the impedimetric immunosensor showed a linear response range between 7,140 and 16,670 particles/mL for VACV, with a limit of detection (LOD) of 639 particles/mL and a limit of quantification (LOQ) of 2,121 particles/mL. Cross-reaction analysis with other viral samples showed that only monkeypox presented a significant signal, corresponding to 55% of that obtained for VACV. These results indicate the applicability of the proposed immunosensor for detecting VACV in biological samples, using PGE in a simple and accessible way.