Dissertação/Tese Biophysical and Structural studies of Bioactive Peptides Derived From the Piscidin Family in Anionic Membrane Models - PPGQ

O desenvolvimento de bactérias multirresistentes (MDR) devido ao uso inadequado e excessivo de antibióticos demanda urgentemente por novos agentes antimicrobianos, além de estratégias alternativas no enfrentamento das infecções causadas por esse tipo de bactérias. Os peptídeos antimicrobianos (PAM), têm atraído grande atenção devido à sua eficaz atividade contra bactérias MDR e ao menor desenvolvimento de resistência bacteriana. Neste trabalho, apresentamos estudos estruturais e biofísicos de três peptídeos, dois isolados naturalmente da espécie Epinephelus coiodes, denominado ecPis-4s e ecPis-2s, e do epímero sintético D-ecPis-2s. A estrutura, modo de interação e atividade de ecPis-4s foi investigado em presença de membranas modelo formadas por POPC:POPG (3:1, mol:mol) e micelas de SDS. Experimentos utilizando a espectroscopia de CD demonstraram que ecPis-4s apresenta um alto teor de estrutura helicoidal em presença de vesículas de POPC:POPG e micelas de SDS.A estrutura tridimensional por RMN em solução obtida na presença de micelas de SDS-d25 mostrou uma conformação helicoidal e anfipática ao longo de toda a cadeia de ecPis-4s. A espectroscopia de RMN de estado sólido em presença de bicamadas lipídicas orientadas foi utilizada para determinar a topologia peptídica na presença de membranas formadas por POPC:POPG (3:1, mol:mol) e em extrato lipídico da bactéria E. coli. Os resultados apresentam um deslocamento químico em torno de 70 ppm que indica que o peptídeo adota uma orientação de superfície com um ângulo de inclinação próximo a 90°. Experimentos de carboxifluoresceína (CF), DLS e potencial zeta demonstraram uma alta atividade lítica de ecPis-4s na presença de vesículas carregadas negativamente e uma perturbação significativa da membrana a partir de uma razão molar peptídeo:membrana de 0,06. Os resultados obtidos para esse peptídeo em presença de modelos de interação indicam que ecPis-4s adota uma conformação helicoidal anfipática bem definida que se alinha paralelamente à superfície da bicamada fosfolipídica, apresentando ainda uma alta afinidade para membranas aniônicas e uma atividade lítica dependente da concentração. Experimentos empregando o peptídeo ecPis-4s em solução aquosa e em presença de tampão fosfato pH 6 e pH 8 também foram realizados. Para acessar a estrutura conformacional de ecPiscidin-4 em água, ou seja, na ausência de um meio mimético de interação e em diferentes pHs foi utilizado a técnica de dicroísmo circular (CD). Após interpretação dos dados obtidos por CD, a estrutura secundária de ecPis-4s em meio aquoso foi calculada em alta resolução utilizando espectroscopia de RMN de solução apresentando um segmento helicoidal definido a partir do resíduo de K10 a R20. Ensaios de fluorescência permitiram determinar a concentração crítica de agregação (CAC) e os dados de ITC revelaram o calor de desestruturação do peptídeo ecPis-4s. Além disso, nossos estudos demonstraram que a ecPis-4s é capaz de resistir à ação de duas enzimas proteolíticas diferentes. ecPis-4s apresentou ainda uma alta atividade antimicrobiana contra cepa bacteriana S. aureus, na presença da enzima proteinase K. Quando realizamos ensaios de cinética de crescimento na presença dessa enzima, ecPis-4s atingiu um desempenho bactericida em 8 h. Estudos biológicos dos peptídeos ecPis-2s e o mutante sintético D-ecPis-2s mostraram que ambos os peptídeos apresentaram atividade antimicrobiana contras cepas bacterianas Gram-positiva e Gram-negativa, no entanto, o epímero D-ecPis-2s mostrou uma atividade biológica quatro vezes maior contra S. typhimurium e P. aeruginosa em comparação com o L-epímero. Ensaios estruturais por CD indicam que L-ecPis-2s apresentam estrutura -helicoidal independente da variação do pH. Por outro lado, os resultados para o epímero D- indicam um estado ordenado de transição entre estruturas -helicoidas e -folha, entre o pH 5,0 e pH 7,0. Embora ambos os peptídeos sejam semelhantes, D-ecPis-2s apresenta uma maior homogeneidade e uma orientação definida na bicamada de POPC:POPG (3:1, mol:mol), como indicado pelos dados de deslocamento de 2H ssNMR. Logo, esse dado sugere uma ancoragem mais eficiente no núcleo hidrofóbico no modelo de membrana bacteriana.

The development of multidrug-resistant (MDR) bacteria due to the improper and overuse of antibiotics as well as their ineffective performance against several bacteria strains have urgently called for alternative antimicrobial agents and strategies in facing bacterial infections. Antimicrobial peptides (AMP), owing to their compelling antimicrobial activity against MDR bacteria and low causing bacteria resistance, have attracted extensive attention in the research field. In this study, we presented biophysical and structural studies of three peptides, two of them originally isolated from Epinephelus coiodes named ecPis-4s and ecPis-2s; and in addiction its synthetic epimer D-ecPis-2s. The structure, mode of interaction, and activity of ecPis-4s was investigated in the presence of POPC:POPG (3:1, mol:mol) negative mimetic membranes and SDS micelles. Experiments using CD spectroscopy demonstrated that ecPis-4s has a high content of helical structure in the presence of POPC:POPG vesicles, and SDS micelles. The three-dimensional structure obtained by solution NMR in the presence of SDS-d25 micelles showed a helical and amphipathic conformation along the entire ecPis-4s chain. 15N and 2H solid-state NMR spectroscopy in the presence of oriented lipid bilayers was used to determine the ecPis-4s topology in the presence of membranes constituted of POPC:POPG (3:1, mol:mol), and in a lipid extract of E. coli. The results show a chemical shift around 70 ppm, which indicates that the peptide adopts an orientation with an angle close to 90° to the bilayer surface. Carboxyfluorescein (CF), DLS and zeta potential experiments demonstrated a high lytic activity of ecPis-4s in the presence of negatively charged vesicles, and a significant membrane perturbation at 0.06 peptide:membrane ratio. The results obtained for this peptide in the presence of membrane models indicate that ecPis-4s adopts a well-defined amphipathic helical conformation that aligns parallel to the surface of the phospholipid bilayer. Additionally, it exhibits high affinity for anionic membranes and concentration-dependent lytic activity. Experiments using the peptide ecPis-4s in aqueous solution and in the presence of phosphate buffer at pH 6 and pH 8 were also performed. To access the conformational structure of ecPiscidin-4 in the absence of a mimetic interaction medium and at different pH values, circular dichroism (CD) technique was employed. Next interpreting the data obtained by CD, the secondary structure of ecPis-4s in an aqueous medium was calculated at high resolution using solution NMR spectroscopy, revealing a helical segment defined from residue K10 to R20. Fluorescence assays allowed us to determine the critical aggregation concentration (CAC), and ITC data revealed the heat of disassembly for the ecPis-4s peptide. Furthermore, our studies demonstrated that ecPis-4s is capable of resisting the action of two different proteolytic enzymes. In the presence of the proteinase K enzyme, ecPis-4s exhibited high antimicrobial activity against the bacterial strain S. aureus. When we led growth kinetics assays with this enzyme, ecPis-4s achieved bactericidal performance within 8 hours. Biological assays showed that both ecPis-2s and the synthetic mutant D-ecPis-2s present antimicrobial activity against Gram-positive and Gram-negative bacterial strains, however, D-epimer showed a higher biological activity against S. typhimurium and P. aeruginosa compared to L-epimer. Structural assays using CD spectroscopy indicates that L-ecPis-2s have an α-helical structure independent of pH variation. On the other hand, the results for the D- epimer indicate an ordered transition state between -helical and -sheet conformation at pH values from 5 up to 7. Although both peptides present similar primary structure, D-ecPis-2s shows a higher homogeneity and a defined topology in the POPC:POPG bilayer (3:1, mol:mol) as indicate by 2H ssNMR data. This finding suggests a more efficient anchorage in the hydrophobic core of the bacterial membrane model.