Dissertação/Tese Effect of Membrane Interactions on the Biophysical and Structural Properties of Bioactive Peptides Derived from the Lycosa Toxin LyeTx I - PPGQ

Peptídeos antimicrobianos sintéticos, derivados de LyeTx I - uma toxina da Lycosa isolada do veneno da aranha Lycosa erythrognatha - demonstraram um potencial significativo tanto como agentes antimicrobianos quanto anticancerígenos. O peptídeo derivado LyeTx I-b apresenta eficácia antimicrobiana contra várias espécies bacterianas resistentes e uma seletividade em comparação ao nativo. A PEGuilação resultou em LyeTx I-bPEG, que é quatro vezes menos tóxico, mantendo sua eficácia contra bactérias resistentes, incluindo aquelas causadoras de mastite bovina, e eficácia in vitro contra células tumorais. LyeTx I mnΔK é uma variante minimizada de LyeTx I, composta por 15 resíduos de aminoácidos, com atividade contra Acinetobacter baumannii resistente a carbapenêmicos (CRAB) e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Este trabalho apresenta uma investigação estrutural e biofísica desses peptídeos derivados da toxina Lycosa LyeTx I, com o objetivo de compreender como as mudanças estruturais no peptídeo nativo afetam a interação com a membrana. Utilizando peptídeos marcados isotopicamente e não marcados, sintetizados por síntese em fase sólida, foram utilizados RMN em solução e em estado sólido para determinar a topologia das estruturas tridimensionais dos peptídeos investigados na presença de membranas miméticas bacterianas. Um conjunto de técnicas biofísicas, como fluorescência, calorimetria de titulação isotérmica (ITC), calorimetria de varredura diferencial (DSC), dicroísmo circular (CD), potencial Zeta, entre outras, foram utilizadas para compreender o efeito da interação peptídeo- membrana na estabilidade das bicamadas de fosfolipídios. Inicialmente, o modo de interação com a membrana de LyeTx I-b e LyeTx I-bPEG foi investigado, com comparações feitas ao LyeTx I nativo. O LyeTx I-b apresenta uma conformação helicoidal anfipática mais pronunciada em uma estrutura bem ordenada, e, consequentemente, uma afinidade aumentada com membranas aniônicas. Para LyeTx I-bPEG, foi demonstrado por meio de estudos de degradação proteolítica que as modificações estruturais impactaram na resistência dos peptídeos às peptidases. As propriedades estruturais de LyeTx I mnΔK confirmam sua conformação α-hélice, apesar da deleção de resíduos C-terminais, revelando uma estrutura robusta. Investigações adicionais sobre as interações peptídeo-vesícula indicam uma forte afinidade por membranas aniônicas compostas por POPC:POPG ou POPG:CL, e baixa afinidade com membranas POPC, destacando a seletividade do peptídeo e seu potencial de direcionamento à membrana. Além disso, o peptídeo minimizado revelou afinidade semelhante com as membranas POPG:CL e LysylPOPG:POPG:CL, o que ajuda a explicar sua alta atividade, mesmo contra MRSA. Dada a importância biotecnológica da versão minimizada, uma nova variante, LyeTx I mnΔKwN, que envolve a remoção de um resíduo de asparagina, foi desenvolvida. LyeTx I mnΔKwN mostra melhorias notáveis na eficácia contra bactérias gram- positivas, incluindo Enterococcus faecium resistente à vancomicina (VRE) e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), com um índice de seletividade aprimorado que destaca seu potencial como um agente antimicrobiano direcionado. Finalmente, análises estruturais confirmam a preservação de sua conformação α-hélice e um modo de interação ainda mais ordenado com membranas aniônicas em comparação com o LyeTx I mnΔK. Esses resultados, ordenado com membranas aniônicas em comparação com o LyeTx I mnΔK. Esses resultados, coletivamente, sugerem que LyeTx I mnΔKwN oferece caminhos promissores para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos direcionados a cepas

Synthetic antimicrobial peptides, derived from the LyeTx I, a Lycosa toxin isolated from the venom of the spider Lycosa erythrognatha, have demonstrated significant potential as both antimicrobial and anticancer agents. The derivative peptide LyeTx I-b exhibits notable antimicrobial efficacy against several resistant bacterial species and improved selectivity than the wild-type. PEGylation produced LyeTx I-bPEG, which is four times less toxic while maintaining efficacy against resistant bacteria, including bovine mastitis, and in vitro against tumor cells. LyeTx I mnΔK is a truncated variant of LyeTx I composed by 15 amino acid residues with enhanced activity against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CRAB) and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). This work presents a structural and biophysical investigation of these derivative peptides from the Lycosa toxin LyeTx I, in order to understand how structural changes in the native peptide affect the membrane interaction. By employing isotopically labeled and unlabeled peptides synthesized via solid-phase peptide synthesis, solution and solid-state NMR were used to determine the topology of tree dimensional structures of the investigated peptides in the presence of bacterial mimetic membranes. A set of biophysical techniques such as fluorescence, isothermal titration calorimetry (ITC), differential scanning calorimetry (DSC), circular dichroism (CD), zeta potential among others, were used to understand the effect of the peptide-membrane interaction on the phospholipid bilayers stability. Firstly, the mode of membrane interaction of both LyeTx I-b and LyeTx I-bPEG was investigated with comparisons drawn to the native LyeTx I. In fact, LyeTx I-b presents higher amphipathic helical conformation in a well-ordered structure, and consequently enhanced affinity with anionic membranes. For LyeTx I-bPEG, it was demonstrated through proteolytic degradation studies that structural modifications changed the resistance of the peptides to proteases. The structural properties of LyeTx I mnΔK confirm its α-helical conformation despite the deletion of C-terminal residues, revealing a robust structural framework. Further investigations into peptide-vesicle interactions indicate a strong affinity for anionic membranes composed by either POPC:POPG or POPG:CL, and low affinity with POPC membranes, highlighting the peptide’s selectivity and membrane-targeting potential. In addition, this shortened peptide revealed similar affinity with POPG:CL and LysylPOPG:POPG:CL membranes, which helps to explain its high activity even against MRSA. In view of the biotechnological potential of the shortened version, a new variant LyeTx I mnΔKwN, which involves the removal of an asparagine residue, was developed in this work. LyeTx I mnΔKwN, shows remarkable improvements in efficacy against gram-positive bacteria, including vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE) and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), with enhanced selectivity index underscores its potential as a targeted antimicrobial agent. Finally, structural analyses confirm the preservation of its α helical conformation and even more ordered mode of interaction with anionic membranes when compared to the LyeTx I mnΔK. These findings collectively suggest that LyeTx I mnΔKwN offers promising avenues for developing new therapeutics targeting resistant bacterial strains, addressing urgent healthcare challenges posed by antimicrobial resistance.